V Laboratoři molekulární biofyziky a farmakologie Biofyzikálního ústavu AV ČR v Brně se již téměř 20 let zabýváme studiem molekulárních mechanismů protinádorové účinnosti komplexů platiny. V roce 1999 se konal v Oxfordu kongres, jehož hlavním tématem byl současný stav vývoje protinádorově účinných komplexů platiny. Na kongres byli pozváni také autoři tohoto článku k prezentaci výsledků získaných v brněnské laboratoři při biofyzikálním studiu molekulárních mechanismů protinádorového působení komplexů platiny.
Kongres se konal při příležitosti 30. výročí objevu protinádorové účinnosti cis-diammindichloroplatnatého komplexu, známého spíše pod běžně užívaným názvem cisplatina. Je zajímavé, že k tomuto důležitému objevu došlo náhodně, asi 125 let poté, co byla poprvé popsána syntéza tohoto komplexu. Na Michiganské státní univerzitě se pokoušeli v 60. letech minulého století studovat jeden zajímavý biofyzikální problém – vliv elektrického pole na růst bakterií Escherichia coli. Pokusy američtí vědci prováděli takovým způsobem, že do nádobky s bakteriemi v živné půdě ponořili dvě platinové elektrody, mezi které vložili elektrické napětí. Výsledkem bylo zastavení dělení bakteriálních buněk, avšak posléze byly identifikovány jako faktor zodpovědný za tento jev platinové koordinační sloučeniny (cisplatina a její analogy), které vznikly při elektrolytických dějích na platinových elektrodách. Další vývoj již byl více méně přímočarý. Pracovní hypotézu, že i dělení jiných rychle se dělících buněk, například buněk nádorových, by mohlo být také zastaveno koordinačními platnatými komplexy, se podařilo prokázat i při klinickém zkoušení. V současné době patří cisplatina a její přímý analog karboplatina (cis-diammincyklobutandikarboxylátoplatnatý komplex) k nejčastěji předpisovaným protinádorově účinným léčivům s obratem přesahujícím jen v USA půl miliardy dolarů ročně. Tato cytostatika jsou využívána k léčbě celé řady typů rakoviny, jako jsou nádory hlavy, krku, plic a genitourinárního traktu. Největších úspěchů je dosahováno při léčení rakoviny varlat, tj. nemoci s historicky velmi nízkým přežitím do doby, než bylo při její léčbě započato s aplikací cisplatiny. Unikátnost cisplatiny je podtržena skutečností, že vlastně jde o velmi jednoduchou, čistě anorganickou sloučeninu, která je složena pouze z 11 atomů, šest z nich jsou ty nejjednodušší, tj. atomy vodíku.
Přes nesporně velký úspěch při léčbě rakoviny je aplikace cisplatiny spojena s řadou omezení. Jde především o relativně úzké spektrum nádorů, které jsou k tomuto cytostatiku citlivé. Například nejčastěji se vyskytující nádory – tlustého střeva a prsu – jsou vůči působení cisplatiny jen velmi málo citlivé. Další omezení souvisí s tzv. získanou resistencí, kdy nádorové buňky původně k cisplatině citlivé se po opakované léčbě cisplatinou stávají vůči jejímu působení resistentní. V neposlední řadě patří k nepříznivým faktorům ovlivňujícím léčbu cisplatinou také vedlejší účinky, nevolnost a zhoršená funkce ledvin. Nepřekvapuje proto, že vývoj nových protinádorově účinných komplexů platiny, jejichž protinádorové účinky by byly lepší nebo alespoň alternativní, než je tomu v případě použití cisplatiny, představuje v době nedávné i současné velmi aktuální téma jak pro základní, tak i pro aplikovaný výzkum. Strategie pro tento výzkum vychází z neustále zdokonalovaného teoretického zázemí shrnujícího znalosti mechanismu biologického působení těch platinových komplexů, u kterých jsou jejich protinádorové účinky velmi dobře popsané.
Prvním krokem při studiu molekulárních mechanismů biologické aktivity chemoterapeutik je určení jejich cílového místa působení v buňkách. Cílové místo farmakologického působení platinových cytostatik může být definováno jako místo v buňce, které je působením léčiva pozměněno a jehož modifikace vede k buněčné smrti. Existuje velké množství experimentálních důkazů, které jednoznačně určují, že hlavním cílovým místem cytostatického působení platinových komplexů je DNA. Úspěšnost komplexů platiny usmrcovat nádorové buňky je dána schopností těchto komplexů vázat se koordinační vazbou k bázím v DNA a vytvářet v ní různé typy kovalentních můstků. Nejčastěji se vyskytujícím můstkem, který v DNA vytváří cisplatina, je můstek spojující dvě bezprostředně sousedící báze v jednom řetězci DNA, přednostně zbytky guaninu. Tyto můstky výrazným způsobem ovlivňují strukturní a další fyzikální vlastnosti DNA. Například tvorba tohoto můstku je spojena s odvinutím dvojité šroubovice DNA o 13 °, ohnutím podélné osy dvojité šroubovice o 32 ° směrem do jejího velkého žlábku, narušením vodíkových vazeb v párech bází spojených můstkem cisplatiny, dále se úzký žlábek DNA v místě naproti tomuto můstku rozšíří a stane se mělčím. Další důležitou vlastností těchto můstků je jejich schopnost zastavovat v místech jejich vzniku replikaci DNA, tj. pro dělení buňky klíčový proces, během kterého jsou před rozdělením buňky syntetizovány nové molekuly DNA.
Na takové výrazné změny v DNA samozřejmě buňka rovněž výrazným způsobem reaguje. Bylo ukázáno, že po poškození DNA cisplatinou je okamžitě aktivován proces vedoucí k jeho opravě. Nejčastěji jde o tzv. excisní nukleotidovou opravu, během které je poškození vystřiženo a vystřižené místo nahrazeno novým nepoškozeným fragmentem DNA. Rychlá oprava poškození DNA cisplatinou by však vedla ke ztrátě jejího cytostatického efektu, jinými slovy pro protinádorový efekt je naopak důležité, aby poškození DNA, bránící její replikaci, přetrvalo co nejdelší dobu. Bylo tedy zjevné, že musí existovat nějaký jiný proces v buňce, který by rychlé opravě poškození DNA cisplatinou zabránil.
Dalším logickým krokem při postupném odhalování podrobností mechanismu protinádorové účinnosti cisplatiny byla identifikace proteinů, které se specificky váží k úsekům DNA poškozeným cisplatinou. Dosud bylo identifikováno několik desítek takových proteinů, které v buňce zastávají velmi důležité funkce. Mezi ty, jež se váží k DNA poškozené cisplatinou s nejvyšší afinitou, patří také histon H1 nebo proteiny obsahující tzv. doménu HMG, vyskytující se v buňkách v relativně vysokých koncentracích. Proteiny obsahující HMG doménu hrají důležitou roli při tvorbě komplexů DNA-protein nebo protein-protein, jsou také molekulami signálními v procesech opravy DNA a jsou často tzv. transkripčními faktory, tj. látkami, bez jejichž účasti většinou nemůže proběhnout jeden z dalších velmi důležitých buněčných dějů, kterým je transkripce DNA [přepis genetické informace obsažené ve strukturních genech (DNA) do mediátorové RNA]. Současný stav znalostí o mechanismu protinádorového působení cisplatiny je založen právě na schopnosti celé řady proteinů specificky rozlišovat a vázat se k DNA modifikované cisplatinou. Jedna z hypotéz (tzv. "stínící") předpokládá, že poškození vyvolaná v DNA cisplatinou jsou stericky odstíněna specificky se vážícími proteiny, což brání v přístupu složek opravného systému k poškozenému místu v DNA a tím jeho opravě. Jiná hypotéza (tzv. "titrační") předpokládá, že proteiny se specifickými funkcemi v buňce se k DNA obsahující poškození cisplatinou váží přednostně a neváží se tedy k jejich přirozeným (normálním) vazebným místům v DNA, čímž se naruší základní buněčné děje. Dalším důležitým dějem relevantním pro protinádorové efekty cisplatiny je schopnost poškození DNA cisplatinou vyvolat programovanou buněčnou smrt (apoptózu).
Obecně jsou toxicita a farmakologické vlastnosti platinových sloučenin dány strukturou a charakteristikami jejich odstupujících (reaktivních) skupin (v molekule cisplatiny to jsou chloridové skupiny). Hledání nového platinového cytostatika vedlo dosud k syntéze pouze dvou nových platnatých komplexů využívaných v klinice, karboplatiny a oxaliplatiny [DACH-(oxalato)platnatý komplex, DACH = 1,2-diaminocyclohexane]. Tyto komplexy však nepředstavují zásadní průlom v chemoterapii rakoviny platinovými cytostatiky, protože zejména spektrum nádorů citlivých na působení těchto nových sloučenin je velmi podobné relativně úzkému spektru nádorů citlivých vůči cisplatině. Na základě našich zkušeností bylo možné tento výsledek očekávat, neboť se ukázalo, že oba nové komplexy – přímé analogy cisplatiny – modifikují DNA (která je hlavním cílovým místem farmakologického působení platinových sloučenin) velmi podobným způsobem jako cisplatina. Proto v naší laboratoři již delší dobu úspěšně testujeme hypotézu, podle níž zejména ty komplexy platiny, které se váží k DNA způsobem zásadně odlišným od způsobu vazby cisplatiny a jejích analogů, mají šanci vykazovat biologické účinky, včetně protinádorových výrazně odlišné od účinků cisplatiny.
Testování této hypotézy vedlo k syntéze několika skupin nových komplexů platiny vykazujících protinádorové účinky v nádorech rezistentních vůči cisplatině. Nejslibněji se projevuje tzv. trojjaderný komplex platiny BBR 3464, u kterého je prostorová konfigurace reaktivních (odstupujících) chloridových skupin na první pohled výrazně odlišná od konfigurace těchto skupin v molekule cisplatiny a jejich analogů. Tento komplex byl vyvinut ve spolupráci s partnerským pracovištěm ve Virginia Commonwealth University v Richmondu právě na základě našich počátečních studií, které prokázaly pomocí metod molekulární biofyziky a biologie, že nový trojjaderný komplex se váže k DNA způsobem zásadně odlišným od cisplatiny a že poškození vyvolaná v DNA touto novou sloučeninou jsou rozlišována buněčnými proteiny také výrazně odlišně ve srovnání s rozlišením poškození vyvolaných cisplatinou. Jedním z výrazných rysů modifikace DNA novým trojjaderným komplexem BBR 3464 je vznik můstků v DNA nikoli mezi sousedními bázemi, jako je tomu v případě modifikace cisplatinou, ale tzv. můstků delšího dosahu mezi bázemi v DNA oddělenými několika dalšími páry bází, přičemž výrazné zastoupení mají můstky vznikající mezi bázemi komplementárních řetězců DNA. Nový komplex BBR 3464, který je nyní ve fázi druhého klinického zkoušení, vykazuje protinádorovou aktivitu při koncentracích 10 krát nižších než jsou klinicky efektivní koncentrace cisplatiny. Potvrdil se také předpoklad, že nový komplex bude aktivní i v řadě nádorových buněk vůči působení cisplatiny rezistentních, včetně buněk majících mutovaný gen p53, tj. gen kódující známý tumor supresorový protein p53. Zde je zajímavé zmínit, že více než 60 % nádorových buněk má tento gen pozměněn (mutovaný), přičemž takto mutované buňky jsou k působení cisplatiny rezistentní. I pro tento zajímavý objev jsme nalezli vysvětlení na základě našich výsledků biofyzikální analýzy DNA modifikované novým komplexem BBR 3464. Zcela nedávno jsme v prestižním časopise Journal of Biological Chemistry uveřejnili výsledek prokazující odlišnou vazbu aktivního proteinu p53 k DNA modifikované komplexy platiny výrazně se lišící svými protinádorovými účinky.
Na několika příkladech jsme se v tomto krátkém článku pokusili ukázat, jak může být základní výzkum založený na metodách molekulární biofyziky užitečný při vývoji nových léčiv proti rakovině. Zmiňujeme se o těchto výsledcích také proto, že se naší brněnské laboratoři podařilo pro řešení tematiky související se základním výzkumem protinádorové účinnosti komplexů platiny získat v náročných mezinárodních soutěžích výraznou grantovou podporu, mimo jiné také od prestižních institucí v USA, jako jsou Howard Hughes Medical Institute, a to již pro druhé pětileté období, a National Institutes of Health. Naše laboratoř také koordinuje projekt EU, jehož se zúčastní dalších 10 laboratoří ze zemí EU, Švýcarska a Izraele.
Převzato z Akademického bulletinu Akademie vědˇ České republiky, 10/2001
http://www.kav.cas.cz/press/stranky/archiv/ab/abposl/abposl/abposl.htm
